QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis (IPA)的資料庫整合了專家精心整理的文獻資料以及來自第三方與公開資料庫的大量資訊，涵蓋豐富的microRNA-mRNA調控關係。透過IPA的microRNA Target Filter功能，使用者可輕鬆搜尋大量已知的目標microRNA-mRNA互動關係，並篩選與目標疾病密切相關的microRNAs。進一步結合IPA強大的分子網路分析工具，深入解析這些microRNAs在疾病調控網路中的生物功能與角色，為開發潛在的診斷性生物標記提供更多依據。

 

重點條列

• IPA 精準定位自閉症關鍵路徑
  透過IPA，從17條miRNA的185個高可信標靶mRNA關係中進一步篩選出與自閉症訊號傳導路徑(Autism Signaling Pathway)相關的miRNA-mRNA調控關係，精準掌握疾病的潛在分子機制。
• miR-15a-5p躍升為「主控鍵」
  IPA網路分析顯示miR-15a-5p單獨調控60個標靶基因，位居網路節點中心，凸顯其在ASD病理機制與治療靶點評估上的價值。
• IGF1R／MAPK／mTOR三大通路同時點亮
  IPA網絡分析顯示其中的標靶基因IGF1R、MAPK、mTOR與神經突觸可塑性、神經元生長及細胞訊號傳遞密切相關，是目前ASD藥物研發的熱點，強化4-miRNA panel的臨床轉譯潛力。
• 關鍵3條miRNA連結IGF1R Signaling
  miR-15a-5p、miR-99a-5p、miR-182-5p在與大腦發育相關的IGF1R通路中具有高度影響力，提供後續細胞／動物功能驗證的優先名單。

簡介

自閉症類群障礙(Autism Spectrum Disorder, ASD)是一種多面向的神經發展疾病，其臨床表現多樣，涵蓋社交互動及溝通障礙、興趣狹隘與重複性行為等行為與認知特徵。過去ASD的診斷主要依賴臨床行為觀察，容易導致延遲或誤診，影響治療介入的時機與效果。因此，尋找能夠早期且準確診斷 ASD的生物標記已成為重要的研究方向。然而，目前尚未有經核准可用於ASD診斷的生物標記，顯示仍需進一步探索其分子機制與診斷策略。

研究方法

本研究招募108名2–4歲兒童（66名ASD患者，42名年齡及性別配對的健康對照組），確認兩組人口學特徵無顯著差異後，採集血漿樣本進行分析。透過次世代定序(NGS)技術獲取miRNA表現譜，整合唯一分子識別碼(UMI)降低技術偏差，並以負二項廣義線性(negative binomial Generalized Linear Model)模型篩選組間差異表達miRNAs，進一步以主成分分析(PCA)評估miRNA表現模式的分群特性。為探討臨床關聯性，依據ADOS-2嚴重度分數進行k-medoids聚類分析，並以Spearman相關性檢驗miRNA表現與症狀嚴重度及年齡的關聯。針對跨年齡層（2–4歲與5–12歲）共同差異的17個miRNAs，使用BaseSpace Correlation Engine (BSCE)比對其靶基因在獨立ASD血液及腦組織研究中的異常表現，並進行組織與細胞類型的富集分析。最後，以17個miRNAs建立多元邏輯斯迴歸診斷模型，並以ROC曲線（AUC值）評估其診斷效能。

miRNA分子網路分析

將本研究經驗證的17條miRNAs上傳至IPA，使用microRNA Target Filter根據下列兩個條件過濾已知的miRNA-mRNA調控關係:

 (1) 選擇高可信度預測或經實驗驗證的調控關係。

 (2) 選擇自閉症相關訊號傳導路徑的調控關係。

將過濾後的miRNAs與其對應的標靶基因進行網路分析以了解其在自閉症分子機制當中所扮演的角色。

結果

ASD與對照組之間顯著差異表達的miRNAs具有診斷不同嚴重程度ASD的潛力

在進行差異表達分析、PCA、聚類分析以及相關性分析後，作者得到以下結果:

• 71條miRNAs在ASD與對照組之間有顯著差異表達（圖一）。
• PCA結果顯示ASD樣本與對照組在miRNA表達上呈現明顯區隔，顯示這些miRNAs具有ASD診斷潛力（圖一A）。
• 聚類分析結果顯示，71個顯著差異表達的miRNAs共可分為五個集群(cluster)，且與ADOS-2 (Autism Diagnostic Observation Schedule second edition)分數(4, 7, 10)關聯，分數越大代表ASD的嚴重程度逐漸上升（圖一D）。
• 相關性分析結果顯示特定的miRNA表現量與ASD嚴重程度之間有顯著負相關性（圖一E）。

這些結果表明使用特定miRNA作為區分ASD嚴重程度的生物標記具有潛力。

圖一、ASD患者循環miRNA差異表達及其與病情嚴重程度的關聯性。(A)主成分分析(PCA)散布圖顯示ASD組與對照組之間的分群情形。(B)火山圖(volcano plot)呈現ASD組與對照組之間miRNA的差異表達，設定的閾值為絕對倍數變化≥ 1.5，且經FDR校正後的p值< 0.05。(C) 熱圖顯示 ASD與對照組各樣本中miRNA的表現量。每一列代表一條特定的miRNA，每一欄對應一個樣本。顏色由黑色（低表現量）到黃色（高表現量），反映了相對miRNA表現量。(D) K-medoids分群分析辨識出五個與不同ADOS-2分數程度相關的miRNA集群，顯示各集群具有獨特的表達模式。(E)關聯矩陣呈現特定miRNA表現量與ASD症狀嚴重程度之間的關係。

ASD中年齡與miRNA動態變化相關

相關性研究顯示多條miRNAs的表現量與年齡顯著相關，這種關聯主要出現在ASD組。多數的miRNAs在2-4歲時與年齡呈現正相關，5-12歲則呈現負相關，顯示年齡在ASD患者中與miRNA表現量變化有顯著相關。

跨研究共同出現的17條miRNAs參與ASD的免疫與神經功能調控

比較本研究與先前研究所找到的顯著差異表達miRNAs，確認有17條miRNAs共同出現在兩個研究中。這些miRNAs涉及細胞週期調控、凋亡、免疫反應與神經發育等多種生物功能。進一步以 BSCE分析評估其標靶基因在ASD血液與腦組織中的表現，結果顯示這些miRNAs的標靶基因在多項獨立ASD研究中均異常表達。組織與細胞類型富集分析發現他們主要分布於神經系統（如三叉神經節、丘腦、小腦）及免疫相關細胞（如淋巴細胞與B淋巴母細胞），顯示這組17條miRNAs可能參與ASD的免疫與神經功能調控。

與自閉症訊號傳導路徑相關的miR-15a-5p具ASD的關鍵調控潛力

使用IPA軟體針對17條miRNAs進行路徑分析，篩選出16個高可信度預測且經實驗驗證的miRNA-mRNA調控關係，這些miRNAs共同標靶185個mRNAs（圖二A）。進一步聚焦於與自閉症相關的訊號傳導路徑後，發現miR-15a-5p (hsa-miR-15a-5p)具有最多的標靶mRNAs（共60個），顯示其在ASD調控中可能扮演關鍵角色（圖二C）。

圖二、17條miRNA特徵組的活性及其相關分子路徑總結。(A)16條高可信度預測且經實驗證實之miRNAs的清單，包含其對應的種子序列(seed sequences)與其所標靶的mRNA的數量。(B)6條經實驗證實之miRNAs的清單，亦列出其種子序列與其所標靶的mRNA的數量。(C)自閉症訊號傳導路徑的網路圖，展示這些miRNAs與其參與神經發育與免疫反應的標靶基因之間的交互作用。藍色線條表示對標靶基因預測的下調作用，橘色線條則表示預測的上調作用。

四條miRNAs組成的預測模型具高度診斷自閉症的潛力

邏輯迴歸分析從17條miRNAs中篩選出四條與年齡相關的miRNAs (miR-4433b-5p、miR-15a-5p、miR-335-5p與miR-1180-3p；圖三A)，具有區分ASD與對照組的能力。進一步的分析顯示，這四條miRNAs不僅個別具診斷潛力，組合後更可顯著提升辨識準確度，展現高度敏感性與特異性（圖三B），顯示其作為ASD早期診斷生物標記的潛力。

圖三、四個miRNA標記在鑑別ASD與對照組個體中的診斷效能。(A)二元邏輯迴歸分析結果顯示，四條miRNAs為ASD診斷的有效預測因子，並將年齡因素納入最終模型中。(B)ROC曲線顯示此四條miRNAs組合的整體診斷效能。圖中表格列出該預測組合的曲線下面積(AUC)、95%信賴區間、p值、靈敏度與特異度。藍線代表四條miRNA組合的ROC曲線，紅色對角線則為參考基準線。

IPA重現本篇研究結果

將本研究Table 3中列出的17條跨研究驗證的miRNAs與其表現量資料上傳至IPA平台，並使用miRNA Target Filter功能進行過濾: (1)篩選出具有高可信度預測或經實驗驗證的調控關係；(2)聚焦於與自閉症相關訊號傳導路徑的調控關係。選取所有符合篩選條件的miRNAs並選擇以分子網路形式呈現，結果如圖四所示: miR-16-5p共可調控24調mRNAs，展現廣泛的調控影響，顯示其可能為早期自閉症之關鍵調控分子。而根據IPA資料庫的活性預測分析，miR-16-5p表現量的上升會抑制多數標靶基因的活性。

圖四、與自閉症訊號傳導路徑相關之miRNAs與其標靶基因的分子網路圖。紅色的miRNA代表其在ASD患者中表現量上升，綠色則代表表現量下降。橘色的基因節點表示根據IPA資料庫推測，該基因受到miRNA調控而活化；藍色則代表受到抑制。橘色與藍色線條分別對應於與IPA活性預測一致的正向或負向調控關係，而黃色線條則代表預測結果不一致。圖中以紅色虛線標示的miRNA為miR-16-5p。

結論

• 71條miRNAs在ASD和對照組兒童的血漿之間顯著差異表達，且年齡為影響動態miRNA變化的因素。
• 確認17條miRNAs在跨年齡層ASD患者中皆出現異常表達，並參與神經發育與免疫反應等相關機制，其中miR-16-5p (hsa-miR-15a-5p)可能為關鍵調控因子。
• 建立由miR-4433b-5p、miR-15a-5p、miR-335-5p與miR-1180-3p組成之四標記預測模型，具高度診斷潛力。

本研究支持此四條miRNAs具作為早期ASD診斷生物標記的應用前景，也為未來miRNA作為基礎的診斷工具與治療策略提供重要依據。

 

參考文獻

Salloum-Asfar, S., Ltaief, S. M., Taha, R. Z., Nour-Eldine, W., Abdulla, S. A., & Al-Shammari, A. R. (2025). MicroRNA Profiling Identifies Age-Associated MicroRNAs and Potential Biomarkers for Early Diagnosis of Autism. International Journal of Molecular Sciences, 26(5), 2044.