QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis (IPA) 擁有超過1,460萬筆來自專家註解、臨床研究等資料所建構的知識庫，能提供多樣且細緻的典型路徑、疾病分類與生物功能資訊。透過這些資源，IPA 不僅協助使用者深入解析實驗資料所涉及的病理機制，也能運用其強大的上游調控分析功能，預測參與關鍵路徑與生物功能的調控因子，進一步發掘潛在治療靶點。

 

重點條列

• IPA揭示吸菸者口腔黏膜中的損傷機制
  IPA的路徑分析結果顯示吸菸者口腔黏膜差異表達基因（differential expression genes; DEGs）最顯著富集的典型路徑為「巨噬細胞一氧化氮與活性氧生成（nitric oxide and reactive oxygen production at macrophages）」，並呈現顯著抑制，顯示口腔黏膜局部免疫防禦功能受損。
• miR-8與SMAD2：IPA洞察菸霧對顱面發育影響之潛在關鍵調控分子
  IPA上游調控因子分析結果顯示，miR-8為顱面發育缺陷關鍵調控因子SMAD2的上游調控因子。揭示了吸菸或香菸煙霧可能誘導早期發育障礙所涉及的關鍵調控分子。

簡介

吸菸是造成六分之一非傳染病死亡的元凶，香菸內含超過5000種化合物，其中有98種已被證實對人類致癌或可能致癌。甚至曾發現在癌症患者中抽菸會使病徵惡化以及化療療效減弱。過往研究已證實吸菸會對轉錄體造成特有的影響，包括啟動發炎與氧化反應、改變呼吸道結構，並在不同的組織類型中改變基因表現。而吸菸也是口腔癌的常見致病因素，故本研究旨在利用QIAGEN IPA更深入了解口腔中因接觸香菸煙霧而改變的分子路徑。

研究方法

• 樣本取得：自美國國家生物技術資訊中心（NCBI）基因表現資料庫（GEO）下載吸菸者 （n=5）和從不吸菸者（n=5）頰黏膜樣本的基因表現資料集。
• 生物資訊分析：
  1. 使用GEO2R軟體進行基因差異表達分析
  2. 使用Bioconductor套件clusterProfiler對DEGs進行過表徵分析（over-representation analysis）
  3. 使用SIGnaling Network Open Resource 2.0（SIGNOR 2.0）探索DEGs之間的訊號傳導網路
• IPA分析：使用IPA中的核心分析（Core Analysis）分析DEGs所富集的典型路徑與下游疾病或生物功能，以及尋找能夠解釋吸菸者口腔黏膜的DEGs表現量變化的重要上游調控因子

結果

差異表達基因結果

共發現459個基因在口腔黏膜中顯著差異表達，其中261個基因表現量上調，198個表現量下調（圖一）。其中：

• 多個基因（如 CHD5、QKI、BATF3、IL6R）在吸菸者中有明顯改變，可能與癌症、免疫功能及肺部疾病風險增加有關。
• 偽基因當中，FMO6P表現量上調，與尼古丁代謝及成癮風險相關；ZNF259P1和ZNF702P 亦表現上升，分別與肺腺癌腫瘤大小及卵巢癌細胞基因調控相關，可能參與吸菸相關的腫瘤進程。

圖一、吸菸者口腔黏膜中差異表達最顯著基因的火山圖。灰色點表示不具顯著性，綠色點表示具有顯著的log2倍數變化（log2FC），藍色點表示具有顯著的p值，紅色點則同時具有顯著的log2倍數變化和p值。

典型路徑與下游疾病或生物功能富集分析

利用IPA的下游疾病與生物功能分析，發現吸菸者口腔黏膜中的DEGs前五名最顯著富集的疾病或生物功能為：

• 生物體損傷/異常（Organismal injury/abnormalities）
• 癌症（Cancer）
• 腸胃道疾病（Gastrointestinal disease）
• 內分泌系統失調（Endocrine system disorders）
• 生殖系統疾病（Reproductive system disease）

而在經典路徑（Canonical pathway）富集分析中，發現最顯著富集的前五名路徑為：

• 巨噬細胞一氧化氮與活性氧生成（Nitric oxide and reactive oxygen production at macrophages）
• 視黃醇生物合成路徑（Retinol biosynthesis pathways）
• 甲狀腺腫瘤信號傳導路徑（Thyroid tumor signaling pathways）
• 胰島素信號傳導路徑（Insulin signaling pathways）
• 類風濕性關節炎中的巨噬細胞／纖維母細胞與內皮細胞（Macrophages/fibroblasts and endothelial cells in rheumatoid arthritis）

其中最顯著富集且抑制的路徑為巨噬細胞中的一氧化氮與活性氧生成路徑，顯示吸菸可能干擾正常的氧化還原平衡與免疫防禦功能，進而影響氧化壓力調控並提高相關疾病風險。

上游調控因子分析

IPA預測的前20名上游調控因子（圖二）含：

• TP53、APP、SMAD3、TNF等蛋白質
  其中，TP63為最顯著抑制的上游調控因子。而TP53則是在吸菸者口腔黏膜中差異表達最顯著的上游調控因子，其為關鍵的腫瘤抑制基因，吸菸已知會改變其突變型態與頻率，特別在肺癌中常見與菸害相關的G→T轉換突變。
• 藥物Dexamethasone （圖三A）
  IPA的分析結果顯示Dexamethasone透過間接交互作用影響78個基因的表現，此藥物的作用為強效的抗發炎以及免疫抑制，顯示下游的DEGs多數可能涉及相關生物過程。
• microRNA miR-8（圖三B）
  miR-8被預測為活化的上游調控因子，其可調控7個DEGs，可能參與吸菸相關的基因表現變化。

圖二、IPA預測吸菸者口腔黏膜中排名前幾位的上游調控因子。正z-score表示活化，而負z-score 表示抑制。

 

圖三、上游調控因子dexamethasone與miR-8。
A. 化學藥物dexamethasone在吸菸者的口腔黏膜中預測為被活化，具統計顯著性（P值 = 1.10 × 10^-6，z-score = 0.438）。
B. microRNA miR-8亦預測為在吸菸者口腔黏膜中被活化（P值 = 8.90 × 10⁻²，z-score = 2.1）。不同圖形代表不同的分子類別。紅色與綠色分別表示上傳資料集中基因表現量的上調與下調；藍色與橙色則是代表根據IPA知識庫中大量收錄的上下游調控關係，在比對上傳基因的表現量變化後，預測該上游調控因子被抑制（藍色）或活化（橙色）。實線代表直接交互作用，虛線代表間接交互作用，點線則代表基於文獻資料庫得出的相關性。星號 (*) 表示資料集中有多個識別碼對應至單一基因或化學物質。

吸菸者口腔黏膜基因變化與多重疾病及SMAD2調控的關聯

利用clusterProfiler進行路徑與over-representation analysis，顯示在吸菸者口腔黏膜中，與顱縫早閉症（craniosynostosis）和子宮肌瘤（fibroid tumors）有關的基因顯著富集（圖四）。

• 顱縫早閉症：與妊娠期間吸菸有顯著相關，亦有其他研究顯示母體吸菸亦與TGF-α 基因變異交互作用，可能增加胎兒顱顏發育缺陷的風險。
• 子宮肌瘤：與吸菸的關係為正面、負面或無關，目前尚未定論。然而，已知吸菸具抗雌激素效應，與自然停經時間提前，以及部分雌激素相關癌症的風險下降有關。
• 訊號傳導網路分析中，SMAD2為與最多DEGs互動的核心基因。而IPA的上游調控分析顯示，SMAD2為microRNA miR-8的調控標靶基因。
• SMAD2參與之生物過程：SMAD2 為轉化生長因子-β（TGF-β）超家族訊號傳遞的關鍵媒介，參與細胞分化、增殖、遷移與凋亡等過程。
• SMAD2的突變影響：小鼠模型中，SMAD2 突變與複雜的顱顏缺陷有關，顯示其在早期發育中的重要性。

圖四、對差異表達最顯著基因 (p < 0.05) 進行的over-representation analysis。圓圈的大小對應到該生物學過程的基因數量，而顏色越紅則表示顯著性越高。

IPA重現本篇結果

將本研究Table S1提供之差異表達基因列表與其表現量資料上傳至IPA軟體進行核心分析（Core Analysis）。分析結果如下所示：

路徑富集分析結果

研究中最顯著富集的五條路徑除了視黃醇生物合成路徑（Retinol Biosynthesis）無預測活性方向之外，其餘四條路徑皆被預測為抑制。

圖五、IPA重現典型路徑富集分析結果。長條圖為藍色代表該路徑被預測為抑制，灰色則代表無活性方向預測。長條圖右側的數字為-log轉換的p值。

上游調控因子分析

1. 藥物dexamethasone作為上游調控因子被預測活化，並總共調控下游82個基因。

圖六、IPA重現上游調控因子化學藥物dexamethasone之結果。

2. microRNA miR-8作為上游調控因子被預測為活化，調控下游8個基因。其中顱面發育相關的SMAD2受miR-8調控且被預測抑制。

圖七、IPA重現上游調控因子microRNA miR-8之結果。

結論

• 本研究結果突顯發炎反應與氧化壓力在吸菸誘發組織損傷中的關鍵角色，特別是一氧化氮相關的發炎路徑為主要影響機制之一。
• 與顱縫早閉症和子宮肌瘤相關的基因在吸菸者中顯著富集。其中顱面發育缺陷相關的關鍵因子SMAD2與多個DEGs互動，IPA上游調控分析則預測miR-8為其上游調控因子。

未來研究應深入探討吸菸引起組織損傷時，一氧化氮相關炎症路徑的分子機制與潛在治療標靶。此外，也需釐清香菸的煙霧與miR-8 調控SMAD2相關的顱面發育缺陷之間的關聯。

文獻來源：10.1186/s43042-022-00268-y