飼料量相同，肌肉量不同？IPA帶您破解肉雞飼料效率的秘密
QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis (IPA) 建構於超過1,460萬筆由專家註解與臨床研究所累積的知識庫之上，提供多樣且細緻的典型路徑、疾病分類與生物功能資訊。同時，它能整合文獻證據，呈現分子間的關係網路，協助研究者快速掌握生物調控脈絡。透過IPA的路徑與上游調控因子分析，我們得以揭開傳統畜牧業偏好篩選的表型背後的調控機制，甚至鎖定關鍵上游因子，作為育種時的重要生物標記。這種以分子機制為核心的策略，可以有效提升育種效率，並縮短傳統育種流程的投入周期。
重點條列
- 高飼料效率組雞隻的粒線體能量轉換效率更高
IPA路徑富集分析發現高飼料效率雞隻的粒線體能量代謝相關路徑被富集並活化，並且在電子傳遞鏈上相關蛋白表達也顯著上升 - 內分泌調控推動飼料效率再進化
IPA上游調控因子分析發現三碘甲狀腺素（Triiodothyronine, T3）與黃體素（Progesterone）為活化的顯著上游調控因子，表示可能驅動能量代謝重編程以支持高飼料效率表型 - 降低肌肉細胞骨架生成與維持能量以助攻能量再分配
IPA上游調控因子分析發現與細胞骨架與結構維持相關的顯著上游調控因子被預測為抑制，可能反映細胞維持成本降低，有助於將能量資源優先投入肌肉生長
簡介
預估至2060年，全球人口將增加一倍，糧食產量需提升約100%才能滿足需求。在動物生產農業中，飼料為最大成本來源，因此提升與飼料相關的生產效率是關鍵策略。現今家禽與家畜選育常用的生產效率指標包含：
- 飼料效率（Feed Efficiency, FE）：單位飼料所增加之體重
- 飼料轉換率（Feed Conversion Ratio, FCR）：飼料消耗量與體重增加之比值
- 剩餘採食量（Residual Feed Intake, RFI）：實際採食量與預測採食量之差
然而，僅依靠這些指標進行傳統選育，成本高、週期長，因此能加速育種的生物標記具高度發展價值。
基於過往轉錄組研究，作者假設低FE個體具有特定的固有基因表現模式，且此模式可能受粒線體活性氧（ROS）調控。為更全面驗證此推論，本研究即針對高FE與低FE表型的雄性肉雞（PedM）的胸肌組織進行差異蛋白質體分析，以深入解析影響飼料效率的細胞與分子機制。
材料與方法
樣本採樣
針對100隻6-7週齡期間的雄性肉雞進行FE的測量，測試期間，雞隻的飼料攝取量與進食營養組成皆被控制相同。選取所有肉雞中，FE最高與最低的個體各4隻（n = 4），安樂死後取出新鮮胸肌組織進行冷凍處理，用於後續分析。
主要分析流程
- 胸肌組織樣本萃取總蛋白質後經凝膠內胰蛋白酶消化，以高解析串聯質譜執行shotgun蛋白質體分析
- 將質譜資料透過資料庫比對進行蛋白鑑定，並以光譜計數法對各樣本蛋白表現量進行正規化
- 建立MA plot (Minus–Average plot)，篩選具差異表現之蛋白質，以比較不同FE表型間的蛋白表現變化
- 利用表型影響因子（Phenotypic Impact Factor, PIF）評估蛋白表現差異的生物學重要性
- 結合粒線體蛋白質資料庫，將鑑定蛋白對應至粒線體蛋白質體，以評估與粒線體功能相關的蛋白表現特徵
IPA核心分析（Core Analysis）
為解析差異表現蛋白的功能意義，本研究使用IPA進行核心分析，鑑定差異蛋白所富集的典型路徑、建構具生物學意義的分子網路，並預測可能的上游調控因子。上游調控因子分析（Upstream Analysis）是根據既有文獻中已知的調控與標的分子關係，結合資料集中分子的表現變化方向，推測具關鍵影響力的上游因子及其活性狀態，以釐清FE差異背後的潛在調控機制。
路徑富集與上游調控因子的重疊分析皆以Fisher精確檢定進行，並以p < 0.05判定具有統計顯著性；活性方向則以z-score表示：
- z-score > 2.0預測為活化
- z-score < –2.0預測為抑制
- 未達門檻者視為趨勢性預測
結果
蛋白質表現譜揭示高FE表型的能量代謝優勢
在高FE組中，作者發現蛋白質表現譜結果如下：
- 粒線體能量傳遞蛋白（如SLC25A4、VDAC2）上調；慢縮肌纖維蛋白（如TPM2、ACTC）下調（圖一A）。顯示高FE組偏向快縮型、能量傳遞效率更佳的肌肉特徵
- 91個上調的極端差異PIF蛋白（圖一B）顯示富集於中間絲蛋白相關功能
- 228種粒線體蛋白顯著偏向上調（圖一B），支持高FE表型與粒線體功能（粒線體蛋白質量增加）提升相關，而非僅是粒線體數量增加
圖一、所有蛋白質的差異蛋白豐度與單一蛋白豐度。(A)以紅點顯示所有蛋白中的粒線體蛋白質；(B)以藍點表示前10%極端PIF值的蛋白質。
粒線體功能提升與能量分配優化驅動高FE表型
共152個蛋白質在高FE和低FE雞隻的胸肌組織間差異表達（p < 0.05 & 1.3 ≦ fold change ≦ 15）。
根據典型路徑富集分析結果，作者發現在高FE組中：
- 粒線體功能失調與氧化磷酸化分別為排名第一與第五顯著富集的路徑（表一）
- 氧化磷酸化路徑中與粒線體電子傳遞鏈（複合體 I、II、III、IV、V）相關的蛋白質表現量呈現顯著上升（圖三A），包括ANT/SLC25A4、VDAC1/2，主要負責ADP/ATP轉運及能量傳遞
- IPA的MAP（molecular activity predictor）功能，進一步預測在路徑上複合體I、III、IV、V的活性在高FE組較高（圖三B）
表一、前六顯著富集的典型路徑。對雄性肉雞胸肌差異表達蛋白進行IPA核心分析，依p值排序前六顯著富集的典型路徑。
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Canonical Pathway |
p-value |
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粒線體功能失調路徑(Mitochondrial Dysfunction) |
4.85E-09 |
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糖解作用I路徑(Glycolysis I) |
9.24E-07 |
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小窖介導的內吞作用訊號傳導路徑(Caveolar-mediated Endocytosis Signaling) |
9.62E-07 |
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網格蛋白介導的內吞作用訊號傳導路徑(Clathrin-mediated Endocytosis Signaling) |
1.10E-06 |
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氧化磷酸化路徑(Oxidative Phosphorylation) |
1.38E-06 |
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蛋白質泛素化路徑(Protein Ubiquitination) |
2.87E-06 |
圖三、氧化磷酸化路徑於IPA中顯示的路徑圖。粉紅色填色的分子代表在資料集中表現量顯著上調。橘色則代表IPA的MAP預測其為活化狀態。
根據上游調控因子分析，高FE組中被預測活化的因子如下（表二）：
- 胰島素受體（INSR）與類胰島素生長受體1（IGF1R）
- 此類受體將調控下游PI3K-Akt-mTOR途徑，促進蛋白質合成與肌肉生長
- 下游調控目標蛋白包括5個與電子傳遞鏈相關的蛋白（ATP5O、COX4I1、NDUFV2、UQCRC1、UQCRC2），與上述結果發現的粒線體能量代謝增強具一致性
- NFE2L2
- NFE2L2一般與氧化壓力反應相關，而在高FE組中被預測活化表示其可能透過降低氧化壓力負擔來協助調控細胞代謝流程
- 黃體素（Progesterone）與三碘甲狀腺素（Triiodothyronine, T3）
- 黃體素會促進胰島素/IGF訊號活化，可能參與下游肌肉生長與高FE表型形成
- T3會增加粒線體蛋白表達與能量代謝，這與高FE組粒線體蛋白上調結果一致
- PPARGC1α與PPARα
- 呈現中度活化趨勢，可能促進粒線體生成與粒線體蛋白表達增加
高FE組中被預測抑制的上游調控因子如下（表二）：
- RICTOR
- RICTOR一般參與肌肉細胞骨架形成，其受到抑制可能降低細胞骨架形成的能量負擔，增進能量利用效率
- MAP4K4
- 主要為促進肌肉分化抑制的負調控因子，受到抑制可能有利於高FE雞隻的肌肉發育
- SRF
- 主要調控細胞骨架與肌肉收縮相關基因。其受到抑制將減少細胞結構維持的能量負擔，與RICTOR抑制所造成的結果一致，被推測為高FE表型背後的分子機制之一
表二、在蛋白質體資料集中，預測可能被活化或抑制的上游調控因子。
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上游調控因子 |
預測活性(高FE組) |
z-score |
p-value of overlap |
下游調控目標分子 |
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INSR |
Activated |
2.425 |
4.29E-05 |
ACTA1, GAPDH, TP5O, COX4I1, FABP4, MYOM2, NDUFV2, OGDH, UQCRC1, UQCRC2 |
|
NFE2L2 |
Activated |
2.382 |
1.54E-06 |
ACTG1, SOD1, RF1, EIF4G2, GNB2L1, GPX1, IDE, NARS, PPIB, PSMA5, PSMB1, PSMD1, RYR3 |
|
IGF1R |
Activated |
2.236 |
2.95E-04 |
ACTA1, ATP5O, COX4I1, MYOM2, NDUFV2, UQCRC1, UQCRC2 |
|
黃體素 |
+++ |
1.954 |
4.55E-02 |
ACTA1, CAV1, IDE, KRT15, RAP1B, RYR3, YWHAG |
|
PRKAA2 |
+++ |
1.951 |
3.20E-03 |
ACTA1, ALB, P4HB, COX4I1 |
|
T3 |
+++ |
1.914 |
1.15E-03 |
ACTA1, ACTC1, ALB, APOA1, COX4I1, CTH, FABP4, PRDX3 |
|
PPARA |
+ |
1.571 |
1.18E-03 |
ACTA1, ALDH9A1, APOA1, PBLD, COX4I1, CTH, FABP4, GLUD1, UQCRC1 |
|
PPARGC1A |
+ |
1.531 |
4.37E-05 |
ATP5O, COX4I1, FABP4, GPX1, NDUFV2, PRDX3, SOD1 |
|
SRF |
— |
-1.961 |
1.49E-03 |
ACTA1, ACTC1, CKM, LBD3, MYL1, DMD, GLRX3 |
|
MAP4K4 |
Inhibited |
-2.000 |
6.85E-03 |
NDUFS8, OGDH, PFKM, UQCRC1 |
|
RICTOR |
Inhibited |
-3.873 |
7.58E-11 |
ATP5O, COX4I1, NDUFB8, NDUFS7, NDUFS8, NDUFV2, PPA2, PSMA5, PSMB, PSMD1, PSMD2, RPL12, RPL30, UQCRC1, UQCRC2 |
強、中、弱活化趨勢分別以+++、++、+表示，強抑制趨勢則以 — 表示。目標分子無底線代表在高FE組中下調；有底線則代表上調。
結論
表三、本研究總結重點表。＊代表該項分析結果是由IPA核心分析所挖掘出的高FE表型重要分子機制
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分析結果 |
意義 |
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高FE組預測有4/5個電子傳遞鏈複合體活化＊ |
支持高FE個體具有更高能量代謝效率，粒線體氧化磷酸化能力提升是FE提高的核心原因之一 |
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ANT、VDAC等粒線體跨膜交換蛋白上調 |
增強ATP/ADP交換效率，提升細胞能量供應流通性，有利持續高能量需求的肌肉組織 |
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粒線體蛋白質體（mitoproteome）整體偏向高FE組上調 |
高FE的代謝優勢來自粒線體蛋白質含量提升，而非粒線體數目增加 |
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T3與黃體素被預測為上游活化調控因子＊ |
內分泌訊號可能促進高FE表型能量利用與代謝驅動 |
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PGC1α、PPARα等與粒線體生合成相關的調控因子被預測為上游活化因子＊ |
支持高FE表型具備增強的粒線體生物生成能力，協助維持能量生產需求 |
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NFE2L2被預測為上游活化調控因子＊ |
可能提供更佳的抗氧化能力，降低氧化壓力負擔、提升細胞效率 |
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RICTOR、SRF被預測為上游抑制調控因子＊ |
高FE表型可能降低細胞骨架維持成本，減少能量消耗、提升能量利用效率 |
圖四、蛋白質體資料集上游調控因子分析的摘要圖。在高FE肉雞的胸肌中，根據下游分子表現推測，可能被活化的上游調控因子（橘色標示）包含：黃體素, T3, INSR, IGF1R, PPARA, PGC1α以及NFE2L2；可能被抑制的上游調控因子（藍色標示）則包含：RICTOR, SRF及MAP4K4。圖中橘色與藍色箭頭分別表示下游分子的活化或抑制，橘色線末端的阻斷符號表示該分子可能被抑制，下端藍色阻斷線表示抑制作用減弱；淺綠色箭頭代表下游分子表現趨勢與IPA文獻報告不一致。高FE表型中上調蛋白以紅色表示，下調蛋白以綠色表示。
原始文獻: https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0155679